A seguito dell'apparizione di una piccola statua di poco più di 14 cm, raffigurante una Madonna con in braccio il bambino Gesù, tra i rami di un albero di frassino ad un pastore della zona che aveva invocato un aiuto divino a seguito di un morso di un serpente, fu costruita, con il contributo dei fedeli, una piccola cappella nel luogo del miracolo, inaugurata il 12 settembre 1510. In poco tempo la cappella, gestita prima dai Padri Serviti e poi dai Frati Minori Francescani, diventò un punto d'incontro di numerosi fedeli, i quali portavano doni votivi a seguito delle grazie ricevute. Qui venne pellegrina nel 1514 anche Isabella d'Este, venuta a pregare per il marito Francesco II Gonzaga, malato da tempo. Si decise quindi di costruire intorno alla cappella una chiesa più grande -  la posa della prima pietra avvenne il 18 giugno 1515 - mentre il 14 gennaio 1518, papa Leone X concesse l'autorizzazione per la costruzione di un convento dove potessero alloggiare i monaci. Nel corso dei secoli successivi il santuario si abbellì di numerose opere d'arte e si arricchì economicamente tramite le donazioni dei fedeli: nel 1610 il semplice stile francescano fu rifinito con stucchi in stile barocco, così come fu abbellita la cappella della Madonna. Nel 1652 fu aggiunto il coro ligneo sull'altare principale, mentre nel corso del XVIII secolo fu posto l'organo. Nel 1810, a seguito dell'invasione napoleonica, il santuario subì una grave battuta d'arresto: i monaci furono allontananti dal convento ed una serie di profanazioni interessarono la chiesa; nel 1848 il borgo che era sorto intorno al santuario venne completamente raso a suolo in seguito ad un bombardamento, ma la chiesa riuscì miracolosamente a rimanere intatta. In seguito il convento fu adibito ad usi civili e militari, diventando quartier generale dell'esercito piemontese e poi ospedale comunale anche fin dopo il 1860, data di riapertura riapertura della chiesa, continuando a svolgere la funzione di accoglienza per persone senza fissa dimora e anziani. Nel 1898 sia il convento che la chiesa ritornarono nelle mani dei francescani: la chiesa fu completamente restaurata con il rifacimento sia della facciata che del pavimento e si provvide al restauro delle diverse opere d'arte contenute. Nel 1929 Pio XI concesse l'incoronazione della statua della Madonna del Frassino, avvenuta poi il 24 settembre 1930. Nel 1969 fu realizzata la cappella penitenziale, di stampo moderno, ad opera dell'architetto Avesani, mentre lavori di restauro sono stati effettuati dal 1996 al 1998.